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              氣相色譜法測定啤酒酵母β—葡聚糖含量
              來源:  2015-12-21 10:53 作者:

                以啤酒酵母為原料提取β—葡聚糖,建立了一種氣相色譜測定β—葡聚糖和甘露聚糖(副產物)含量的方法。樣品用三氟乙酸(TFA) 進行水解后,對水解單糖進行乙?;?,制備成糖腈乙酰酯衍生物,然后采用中極性柱進行氣相色譜分析,最后以外標法定量測定。結果表明,β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖成分經乙?;竽艿玫捷^好的色譜分離效果,本實驗制備的產品中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量分別為32.39%和16.82%,回收率為87.14%—101.2%,此法可準確測定β—葡聚糖的含量。


                本文借鑒了一些植物多糖中單糖組分的分析方法,采用氣相色譜法直接測定葡萄糖含量,具有分析速度快、選擇性強、靈敏度高和測定結果精確可靠等優點,從而為啤酒酵母中β—葡聚糖含量的測定提供新參考。


                   1  材料與方法


                   1.1 材料與試劑


                   啤酒酵母廣州市珠江啤酒廠;β—葡聚糖日本ADEKA株式會社;風味蛋白酶、Alcalase2.4L 諾維信公司;丙酮、三氟乙酸、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐等天津市化學試劑一廠,分析純;標準葡萄糖、甘露糖 上海源聚生物科技有限公司,分析純。


                   1.2 .1儀器與設備


                   本實驗采用乙?;鳛檠苌椒?,其反應原理是:標準單糖和鹽酸羥胺在溶劑吡啶中加熱反應生成糖肟,以乙酸酐作為乙?;噭?,在加熱條件下繼續反應,最后生成具有揮發性的糖腈乙酸酯衍生物。


                   GC—2014 氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測器FID ,日本島津公司;KQ—250DE 型數控超聲清洗器,昆山市超聲儀儀器有限公司;雷磁PHS—3C 精密pH 計,上海精科儀器有限公司;N—EVAP111型氮吹儀,美國Organomation公司;5804R型高速冷凍離心機,德國Eppendorf 公司;RE—52型旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠;SHZ—D(III) 型循環水式真空泵,鞏義市予華儀器有限責任公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋,上海博迅實業有限公司醫療設備廠。


                   1.2 .2β—葡聚糖的制備


                   工藝流程:新鮮啤酒酵母→200目過篩除去啤酒花等雜質→水洗除去剩余啤酒→離心分離→將沉淀溶于水配成反應體系進行自溶→加鹽破壁→堿性蛋白酶酶解→離心分離→水洗沉淀→脫色脫脂→冷凍干燥→粉碎→成品


                   操作要點:自溶,在pH7.0環境中,按反應體積1%的量加入風味蛋白酶,50℃下反應24h;破壁,在pH10.5環境中,按反應體積3%的量加入NaCl,攪拌混勻,80℃下保持1h;酶解,在pH10.5環境中,按反應體積1%的量加入Alcalase2 .4L ,攪拌混勻,80℃下反應3h。


                   1.3.1β—葡聚糖和甘露聚糖的單糖含量分析


                方法制備的β—葡聚糖成品中可能還有些其他物質,如甘露聚糖和蛋白質,其中甘露聚糖是由甘露糖構成的同一聚糖,本實驗同時測定甘露聚糖的含量,為β—葡聚糖含量的測定提供參考。


                   準確稱取10mg 固體單糖標準品(先在105 ℃下烘干至恒重)、10mg 鹽酸羥胺于1.5mL小離心管中,加入0.5mL吡啶,放入90℃水浴中加熱反應30min,間歇振蕩。取出后冷卻至室溫,加入0.5mL乙酸酐,90℃下繼續水浴加熱反應30min,離心后取適量上清液直接進行氣相色譜分析。


                   1.3. 2 葡萄糖和甘露糖標準曲線的繪制


               &文章來源華夏酒報nbsp;   準確稱取標準葡萄糖和甘露糖各10mg,乙?;?,葡萄糖和甘露糖衍生物濃度同為10mg/mL,分別將此濃度葡萄糖和甘露糖衍生物按比例混合,配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混合糖液,同時做空白對照,立即進行氣相色譜分析,記錄色譜峰面積,以其為縱坐標,并以混合糖液中每種糖的濃度為橫坐標,繪制標準曲線。


                   1.3.3 啤酒酵母多糖的水解和衍生化準確稱取10mg多糖粉末于10mL離心試管中,加入2mL75%三氟乙酸,封管,90℃下水浴3h,間歇振蕩,待酸水解完取出,將試管接入氮吹儀在80℃下蒸干,再加入1mL甲醇再次蒸干,重復3 次,以去除殘留三氟乙酸。


                   1. 3.4 色譜條件


                   氣相色譜柱:DB—17 石英毛細管柱(30 m×0.32 mm,液膜厚0.25μm,Agilent) ;升溫程序:初溫為160℃,以5℃/min 升溫至180℃,再以2℃/min 升溫至210℃,保留5min ;進樣口溫度:230℃,檢測器溫度:250℃;


                   載氣(氮氣)流速:20mL/min,氫氣流速:45mL/min,空氣流速:400mL/min;分流比20:1,進樣量1μL。


                   乙?;?,標準葡萄糖和甘露糖衍生物的氣相色譜分析結果如圖1 所示,分析表明采用糖腈乙酸酯衍生化的方法,一種單糖只對應一種衍生化產物,在較低的200 ℃下即可分離出來。


                   兩種標準單糖衍生物保留時間分別為14.347min和15.016min,分析表明在1. 3.4 所采用的氣相色譜條件下,混合單糖中的兩種單糖出峰時間短,峰形對稱,隔得較開,并未出現拖尾現象。


                2  實驗分析


                   2 .1 兩種標準單糖衍生物的標準曲線


                   葡萄糖衍生物標準曲線(見圖1 ),甘露糖衍生物標準曲線(見圖2)。

               
                   根據標準葡萄糖和甘露糖衍生物標準曲線繪制的操作步驟。從曲線趨勢來看,兩種單糖衍生物出峰面積隨著糖濃度的增大而呈線性增長。


                   2 .2 樣品水解單糖乙?;a物的氣相色譜分析


                   ADEKA 株式會社是日本最大的β—葡聚糖生產公司,這里將其進口產品與本實驗室制備的成品中葡聚糖和甘露聚糖含量進行比較,將兩種樣品水解并乙?;?,按與混合標樣相同的色譜分析條件進行氣相色譜分析,結果分別如圖4 和圖5 所示,其水解單糖保留時間與標準混合單糖的保留時間對比分析表明,水解后的兩種單糖分別為葡萄糖和甘露糖,其中葡萄糖含量較高。β—葡聚糖水解衍生化氣相色譜圖(見圖3)。


                   2 .3 啤酒酵母中β—葡聚糖和甘露聚糖的含量計算


                   根據樣品中水解后每種單糖氣相分析的峰面積,代入葡萄糖和甘露糖的標準曲線,可算出葡萄糖和甘露糖的濃度,進一步計算出樣品中葡萄糖和甘露糖含量,從而最終得到β—葡聚糖和甘露聚糖的含量,所有計算結果(見表1)。


                   從表1可以看出, 實驗室制備的β—葡聚糖和甘露聚糖與日本進口β—葡聚糖的含量都比較接近。樣品中組分測定的重現性實驗結果(見表2 )。


                   根據2.3測定的結果, 每10mg 樣品中β—葡聚糖和甘露聚糖含量分別為3.239mg和1.682mg,分別添加5mg葡萄糖和甘露糖進行測定,結果如表3所示,加標回收率為87.14%—101.2%,說明該方法準確性高, 能夠滿足檢測要求。樣品中組分的回收率實驗結果(見表3 )。


                   3  結論


                   本實驗建立的啤酒酵母β—葡聚糖含量的氣相色譜測定法,前處理簡單、操作方便、重現性好、選擇性強、精密度高,符合實驗室對β—葡聚糖含量測定方法的要求。


                在這個分析過程中,要注意: 


                第一,糖類衍生化方法要求制備簡便、試劑易得,而且每種單糖要得到單一的色譜峰,這對單糖的定量分析是十分重要的;第二,色譜柱對于分離效果也很重要,在氣相條件探索過程中,比較了AC—5(非極性)和DB—17(中極性)兩種毛細管色譜柱,發現AC-5 出峰慢,分離不徹底,而DB—17 在較低溫度下很快就能出峰,而且不同單糖峰形對稱,分隔較開,效果很好,于是選擇DB—17作為分析色譜柱。


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              編輯:苗倩
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